科学家为研究单细胞代谢夯实技术
时间:2017-12-07

  科学家研究单细胞代谢来巩固技术 - 新闻 - 科学网

  研究人员正在开发创新的方式来理解个体细胞的内部运作。图片来源:Torsten Wittmann / SPL

  Renato Zenobi坐在一楼的办公室里,一个到农场的工业实验室。分析师解释了细胞生物学家面临的一个基本问题。他正在跟踪曲线的简单的钟形曲线,该曲线代表理论细胞群中分子的平均浓度。他解释说,这种分配会隐藏复杂性。为了证明这一点,他绘制了两条与单峰曲线的每条边重合的曲线,每条曲线代表了群体中的一个典型表型,而且也是钟形曲线。要弄清楚这种分布是多峰还是单峰,你需要深入到单个单元层次。在苏黎世瑞士联邦理工学院(ETH)工作的Zenobi。

  细胞异质性是克隆人群中的一些细菌产生抗生素抗性的原因。它引起脑中不同的细胞亚群,并解释了肿瘤的固态萌发。但是,监测这些差异的工具刚刚起步。

  当前的技术进步,尤其是近两年来的技术进步,已经揭示出在相同的细胞群中个体细胞可能存在巨大差异。马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院(NIH)共同基金细胞分析工作组的项目负责人Ananda Roy表示,这种差异可能会对健康和疾病产生重大影响。

  世界各地的赞助商都排队支持单细胞研究。自2014年以来,NIH已经投入了200万美元支持单细胞分析的特殊项目,目前该项目下的60个团队已经获得了奖励。单细胞测量师协会是日本大学和公司之间的合作单位,负责举办单细胞分析和技术研讨会。 2016年10月,专家们讨论了启动人类细胞贴图国际计划,旨在映射每个人类细胞及其特征,这是一项雄心勃勃的任务,严重依赖于单细胞分析。

  小而实际的进展

  对单个酵母细胞的分析导致了Zenobi的研究小组发现了潜伏在相同基因样本中的两种表型,一种叫做L-果糖1.6磷酸二酯的低水平代谢物和另一种代谢产物在较高水平上,这种差异在最后的分析中可能是不同的葡萄糖使用策略,Zenobi说,这个发现没有直接的生物医学应用,但它阐明了细胞工作的基本方式。

  为了获得这些信息,Zenobi的团队使用先进的技术来分离细胞并提高分析方法的灵敏度,Zenobi利用一种特殊的硅晶片,为质谱仪提供了数百个单个细胞,肉眼看来,这些晶圆似乎被称为聚硅氮烷的聚合物外层,经过激光微加工,产生数百到数千个直径为2-300微米的储层。

  Zenobi研究生Robert Steinhoff展示了晶圆如何适应质谱仪。研究人员将基质辅助激光解吸/电离(MALDI)与飞行时间分析仪结合使用,这要求它们驱动化学电离。通过使用最小化由小分子产生的信号的干扰矩阵,团队可以在10至18摩尔的范围内检测较低(10-18摩尔)的代谢,每个晶片约1000个细胞,在单细胞世界这个流量比较高。

  伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校的分析师乔纳森·斯韦德勒(Jonathan Sweedler)开发了一种高通量的方法,使用计算机将激光照射到放置在硅片上的单个电池。通过这种方式,团队每个晶圆可以处理大约10,000个单元。但为了更全面地了解代谢机制,Sweedler一次只能分离一个细胞。使用通常记录电子信号的修改的膜片钳工具,从人脑细胞中提取约3皮升的细胞质(相当于总细胞的10%-40%),并将其加入质谱仪。

  这些有限的通量限制了每个实验对几十个电池的分析。尽管如此,Sweedler的研究小组已经用它来检测大鼠脑切片中30个神经元和星形胶质细胞的60多种代谢,研究团队专注于谷氨酸等神经化学物质以及三磷酸腺苷(ATP)的氨基酸和衍生物。

  不同大小的探索

  处理单细胞时,大小是非常重要的。植物细胞的直径范围可以从10微米到100微米。哺乳动物细胞倾向于更小,约10至20微米。微生物细胞较小,可以达到亚微米级别。由于细胞的大小,代谢物的确切大小和确切数量将会变化。从分析的角度来看,显然这些能力没有单一的解决方案。华盛顿乔治华盛顿大学的化学家阿科斯·韦尔特说。他的实验室使用不同的方法来分析不同大小的细胞。

  对于最大的细胞,研究小组利用锋利的纤维直接向细胞提供尖锐的红外光。光纤刺激细胞中氧与水的结合,导致细胞爆炸并喷射其内容物。这些溢出的物质会遇到一种雾化的离子化液体,称为电喷雾,可以对分子进行电荷分析以进行质谱分析。这种技术的优点是可以在组织内仍然分析单个细胞。但它可能会很慢,因为每个细胞通常需要一个非常耐心的研究生探索纤维,Vertes说。他最近使用电脑来操纵样品台,使这个过程自动化。

  最小的电池被放置在纳米柱上的表面上,纳米柱也是由硅制成的,尽管与斯坦霍夫的设备不同,对整个表面进行成像揭示了设备的离子束需要瞄准单个电池的位置。使用这种方法,团队常规检测femtocerers(飞摩尔,10-15摩尔)的代谢水平。然而,研究人员推测他们的检测下限为800 Zeptol(1 Zeptomir等于10-21摩尔)或约482,000个分子。

  它甚至可以达到较小的水平。瑞典哥德堡大学的生物分析化学家安德鲁·尤因(Andrew Ewing)分析了小分子神经囊泡的含量。尤因使用了一种称为纳米二次离子质谱(NanoSIMS)的方法,用高能铯离子束轰击样本表面。这种攻击将排出表面上的带电粒子,可以通过质谱分析来确定物质的组成。尤因团队使用这种方法来评估神经元小泡多巴胺的分布。

  在日本大阪RIKEN定量生物学中心,化学家TsuMu Masujima利用单一广播针对质谱中使用的单个细胞。个别细胞的行为是非常有趣和意外的,所以我希望尽可能多地看到它们。 Masujima说。

  他的方法包括在视频观察期间将纳喷雾喷雾针直接插入细胞内,抽吸内容物,并使用相同的针将内容物注射到质谱仪中。视频组件的添加使得他的团队能够执行更复杂的任务,例如捕获和分析血液中的单个白细胞和肿瘤细胞的氨基酸和脂质含量。它也允许团队评估分子的丰度。

  让数据合理化

  幸运的是,负责加利福尼亚州Scripps代谢组学和质谱分析中心的化学家Gary Siuzdak说,生物信息学工具可以使这些发现合理化。 Siuzdak的中心运行着一个名为XCMS Online的基于云的代谢物分析平台,该平台有12,000多个用户共享了12万个工作岗位,Siuzdak承认单个细胞参与这些工作非常少,但这并不意味着他们本质上与这些软件不相容,在生物信息学中,我没有看到这些实验的主要问题。

  相比之下,单细胞代谢领域的主要挑战是仪器设备:有足够的设备来研究每个细胞的单个细胞和代谢物,这样的研究的结果在数据方面是有意义的。单细胞的主要问题是硬件还有待改进。 Siuzdak说。研究倾向于分析数十或数百种不同的分子。但是一个酵母细胞有大约600个代谢物。因此,即使是最敏感的分析技术也只能选择最可能的目标,即单个细胞内最常见的分子。那些不太常见的是在雷达范围之外。

  这个问题的一个可能的解决方案可能在于基于数量的工具和各种组合。为代谢物数据集开发的通道和工具来自大量可重复使用的细胞。他说。所有需要做的是对研究人员使用的数据处理和标准化方法进行微调。单细胞转录组已经建立,从中我们可以学习加速生物信息学在单细胞代谢物领域的发展。他加了。

  其他研究人员正在追踪基于质谱仪以外的单细胞分析的策略,特别是使用活细胞。在研究单个细胞代谢物时,关键的技术挑战已经解决,Heinemann说。现在需要做的是单调发展,有效运作。

  我们常常很高兴地发现独特的元素,我的问题是为什么如此呢? Masujima问这个发现背后是什么?为什么这个分子出现?如果没有这种洞察力,技术可能会冒着制造一个不解决生物学重要问题的噱头的风险,我不想成为做这种研究的科学家。

  (冯维维汇编)

  “中国科学”(2017-01-12第3版国际)